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细胞周期检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)
本产品检测原理基于碘化丙啶（Propidium, PI）染色方法分析细胞周期和凋亡。碘化丙啶是一种双链DNA染料，其嵌入双链DNA中可以产生荧光，并且荧光的强度和双链DNA的量成正比。
在细胞周期中，G0和G1期细胞有一套染色体，G2和M期细胞有两套染色体，S期介于两者之间。经过碘化丙啶染色后，处在不同细胞周期中的细胞的荧光强度是不一样的。假定G0和G1期的细胞荧光强度为1，那么G2和M期的细胞的荧光强度为2，S期的细胞介于1和2之间。
细胞凋亡时，由于细胞核皱缩和DNA片段化，染色时DNA片段会从打孔的细胞膜处丢失，流式细胞仪检测时，荧光强度小于1，即Sub-G1峰或者凋亡细胞峰。
细胞凋亡也可以用流式细胞仪观察细胞光散射的变化来检测。凋亡前期，染色质皱缩，细胞密度增加，前向角光散色显著降低。凋亡后期，细胞产生凋亡小体，前向角光散射和侧向角光散色都显著降低。
本试剂盒可用于培养的贴壁细胞或者悬浮细胞检测，也可用于组织细胞检测。
| 产品货号 | 产品规格 | 产品价格 |
|---|---|---|
| C001-50 | 50 assays | 306元 |
| C001-200 | 200 assays | 1046元 |
| C001-500 | 500 assays | 询价 |
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC）
检测原理
细胞在发生凋亡时，会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化，在凋亡中晚期，激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA，DNA会被降解成为约180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT 酶）把FITC标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3'-OH 末端，然后进行荧光显微镜或流式细胞仪检测，这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。
产品优势和特点
7Sea-TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，集成了不同厂家产品的诸多特长，形成优势和特点：- 高活性的重组TdT突变体酶----该转移酶的比活是其他试剂盒里TdT活力的10倍，同样情况下，不被标记的3'-OH 末端可以顺利标记上荧光，因此检测灵敏度更高；
- 经反复优化的标记反应底物----降低了荧光基团相邻后可能造成聚集和淬灭的效果，从而提高检测灵敏度，同时减少非特异性反应；
- 更精确的实验数据----试剂盒提供的PI 核染料，可以将全部标记和未标记细胞的DNA 着色，并在488nm波长激发光下发出红色荧光，从而得以判断凋亡细胞占总细胞比例；
- 一步染色，使用方便----只需一步染色反应，染色完成后洗涤即可观察，约1-2个小时即可完成；
- 应用范围广----既可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
检测方法
荧光显微镜或流式细胞仪样本类型
石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及细胞悬液对照实验
阳性对照细胞
阴性对照细胞- 采用说明书中方法四，标记阳性和阴性对照细胞（细胞采用杂交瘤细胞，阳性为DNaseI处理，阴性不加TdT），反应完成后，直接用荧光显微镜观察FITC和PI染色情况以及白光下的细胞形态（从左至右）；
- 从结果看，阳性对照基本被FITC标记上，阴性对照成团细胞有微弱绿色荧光（可能洗涤不彻底）；
- 以PI染色为参照，阳性对照FITC/PI的比值为阴性对照的300倍以上。
产品规格
| 产品货号 | 产品规格 | 产品价格 |
|---|---|---|
| AT005-1 | 10T | 720元 |
| AT005-2 | 20T | 1300元 |
| AT005-3 | 50T | 询价 |
细胞凋亡检测Annexin V试剂盒
Annexin V是一种分子量为35.8kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，广泛分布于真核细胞胞浆内，参与细胞信号转导。Annexin V能与磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，简称PS） 高亲和力、特异地结合。在正常细胞中，PS主要分布在细胞膜内侧，在细胞发生凋亡的早期，细胞膜上的PS会外翻到细胞表面。
我公司提供荧光分子标记的Annexin V（FITC）以及荧光蛋白分子融合表达的Annexin V (EGFP、RFP)，产品在不同仪器和使用条件下，经严格测试，显示产品使用效果等于或优于进口（见下图）。
| 产品货号 | 产品规格 | 产品价格 |
|---|---|---|
| A005-2 | 20 assays | 498元 |
| A005-3 | 50 assays | 898元 |
| A005-4 | 100 assays | 询价 |
1. 细胞凋亡分析总体原则是什么？
（1）因为细胞凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；
（2) 由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；
(3) 实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性.
2. 检测细胞凋亡选哪几个指标比较有代表性？
（1）判断细胞的死亡是凋亡？还是坏死？（定性分析）
细胞形态观察、Annexin V、TUNEL、 DNA Ladder、Caspase 3活性
（2）判断凋亡的时期或数量（定量分析）
Annexin V流式细胞仪分析、DNA含量分析、凋亡各期分子事件。
（3）判断凋亡信号通路：是内源线粒体通路？还是外源死亡受体通路？
线粒体通路：JC-1染色、Caspase3/ 9活性等；
死亡受体通路：Caspase3/ 8活性、内质网通路、Bap31等
(4) 判断各通路具体的分子调控机制
MYC通路（P53、 ARF等）、NFκB 通路、JNK通路、ARK通路等
3. 检测凋亡之前, 为什么要确定细胞凋亡发生的时间?
由于细胞凋亡不同时间出现的分子事件不同,所以需要在不同的时间点进行采样，取样过早凋亡事件尚未发生,出现假阴性,取样过迟,凋亡完成也检测不出对应的分子变化事件,因此需预试验确定凋亡发生的时间,以保证检测结果的准确性；
4. 凋亡主要包括几条信号通路？代表分子是什么？如何检测？
凋亡信号通路主要包括外源死亡受体通路、内源线粒体通路和内质网通路。
l 外源死亡受体通路 代表分子： TNF、FAS、FASL（CD95L）、TRAIL
及其受体； TRADD、Caspase3、 Caspase 8、NF-κB等
l 内源线粒体通路 代表分子： Bcl-2家族（抗凋亡Bcl-2、Bcl-Xl、Bax
等；诱导凋亡Bid等）、细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9
l 内源内质网通路 代表分子： caspase-12、GADD153/CHOP, ALG-2, VCP BAP31
l 信号分子均可通过蛋白免疫印迹杂交（Western Blotting）、免疫组化检测。
5. Annexin V 有几种荧光标记的？分别是什么？
Annexin V有多种荧光标记的，主要包括：
绿色荧光EGFP/FITC标记，橙红色P E标记，蓝色APC标记。
客户可根椐自已的样本选择如下产品：
Annexin V-EGFP/PI 或Annexin V-FITC/PI，膜绿核红 双染试剂盒
Annexin V-PE/7-AAD 膜橙核红 双染试剂盒
Annexin V-APC/PI膜蓝核红 双染试剂盒
Annexin V-FITC/PI
6. Annexin V/PI试剂盒中是否含有钙离子？为什么？浓度？
Annexin V试剂盒中Binding Buffer含有钙离子，原因：因为Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，试剂盒中Binding Buffer含有钙离子，可以促进Annexin V与PS的结合。Binding Buffer中钙离子浓度为：5mM。
7. 为什么用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞?
Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白， EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。如必须使用含EDTA的胰酶，建议在收集细胞，PBS洗涤细胞后，增加一步用Binding Buffer洗涤细胞。
8. 为什么做Annexin V-FITC/EGFP检测，细胞不能固定?
细胞固定后可能导致荧光的淬灭，所以不要固定样品。
9. 为什么胰酶消化后的细胞建议保存在2％的BSA中?
细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而致使细胞进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2％的BSA中。
10. Anexin V EGFP与FITC有什么区别？
EGFP是一种绿色荧光蛋白，GFP是一种来自水母的生物发光物质, 在紫外光激发下可发绿色荧光. EGFP是GFP的突变体, 其荧光强度比GFP强4 ~35 倍，EGFP分子量(27 kD). 而且无细胞毒性,Annexin V-EGFP是融合的重组蛋白，其绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点, EGFP与PS的结合比例保证为1：1，还可用来定量细胞膜上PS分子数目。而FITC是一种小分子的荧光素，分子量只有389.38，后标记于Annexin V分子上，性质不如Annexin V-EGFP稳定，荧光信号不如Annexin V-EGFP强，荧光易淬灭。
11. 新鲜组织怎样制备成细胞悬液?
小组织块加入1～2mL的冷裂解液，置冰上，用小解剖剪尽量剪切碎；冰上静置5分钟，移液枪小心吸取上清（细胞悬液），弃沉淀（组织残渣）；上清离心1000-2000转/分，细胞沉淀用冷PBS（不含EDTA）洗涤重悬，得细胞悬液。
12. Annexin V，细胞周期和凋亡检测试剂盒是否可以用于检测组织样本？如何做？
Annexin V，细胞周期和凋亡检测试剂盒可以用于检测组织样本。先要把组织制备成细胞悬液后才能进行凋亡检测。
13.检测细胞增殖、细胞活力、细胞毒性有哪些常用的指标、方法和产品？
l MTT、XTT、WST-1 、CCK-8、CFSE、Brdu、SRB等染色方法指示细胞的增殖活力，七海复泰生物高性价比的CCK-8试剂盒。
l 还可用如下各种细胞增殖和细胞周期的标志物抗体检测：BrdU、 PCNA 、Ki67、NIFK、 NuMA p8、CDT2、ECT2、Mitotic Cells、MTMR8 TACC1等抗体，七海复泰生物接收抗体定制订单。
l 细胞周期检测 用细胞周期检测试剂盒进行流式细胞分析，亦可测定各种周期素等表达量，七海复泰生物提供细胞周期检测试剂盒。
14.CCK-8与WST-1、MTT、XTT比较有什么优点?
WST-1实验灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS高，线性范围更宽。且对细胞无明显毒性。显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到测定时间。
CCK-8的实验灵敏度较WST -1高，线性范围更宽，且由于CCK-8溶液相当稳定，并且对细胞没有毒性，可直接加入到细胞样品中长时间孵育。
15.什么是细胞周期？如何检测分析细胞周期？
细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，
① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中；
③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
⑤ G0期为细胞休眠期,暂不分裂
细胞凋亡时，正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，是造成细胞周期差异的主要原因。
细胞周期检测可使用七海复泰生物细胞周期检测试剂盒。
16.七海复泰生物细胞周期试剂盒、七海复泰生物PI染液， Anexin V/PI双染试剂盒中的PI三者有何不同？是否可以相互替代混用？
? 三者中PI的浓度不同；
? 细胞凋亡PI染色试剂盒RNase A客户需要自备，而细胞周期试到剂盒中配有
RNase A；
? 细胞凋亡PI染色试剂盒用荧光显微镜观察和流式细胞仪分析，细胞周期检测试
剂盒用流式细胞仪分析；
? 三者不能相互替代混用。
17.在细胞周期检测结果中出现峰宽情况是什么原因造成的?
? 流式细胞仪的流速太快，建议调整流式细胞仪的流速；
? 样品中有气泡，检查样品中是否有气泡；
? 样品中有坏死细胞，建议更换样品。
18.在细胞周期检测结果中出现无样品峰是什么原因造成的?
可能样品中无细胞核，坏死细胞过多，细胞碎片过多。建议显微镜观察样品或更换样品；
19.七海复泰生物有哪些荧光染料产品，各种染料的作用？激发和发射波长？
细胞荧光染料是生命科学研究中重要的标记物、示踪剂和指示剂，可用于抗体标记、细胞定位、细胞增殖指示、凋亡特征指示、Ca2+离子示踪等作用。
七海复泰生物主要提供或代购细胞核荧光染料（吖啶橙AO、溴化乙锭EB、Hoechst、碘化丙啶PI、DAPI、7-AAD等）；线粒体指示剂（罗丹明123、 JC-1）；内质网指示剂（DiOC6(3) 、FM 1 4 3）；抗体或蛋白标记荧光探针（EGFP、FITC、PE、Cy系列）；活细胞示踪CFSE ；PH指示剂（BCECF-AM、Carboxy SNARF-1）等荧光染料产品。
20.染色时无法区分正常细胞和凋亡细胞原因?
无凋亡细胞或凋亡细胞数量很少，诱导凋亡细胞的方法不正确。延长诱导细胞凋亡的时间，或选择其他的方法诱导细胞凋亡。
21. 流式实验有哪些注意事项？对样本的有何要求？
(1) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。
(2) 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
(3) 操作时注意避光，反应完毕后尽快检测。
(4) 对照组的设置：在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是值。如需知道值时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
(5) 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。
(6) 样品的制备：
流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll 分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA 和柠檬酸盐）消化分散液或洗液,用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS 洗2～3 次后重悬，过一下尼龙或不锈钢网筛孔径100μm 和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL
22.看不懂流式图，是否能帮老师进行结果分析？（如细胞周期、Annexin/ PI双染等）
七海复泰生物技术支持可以帮老师进行流式结果分析，将流式图发送至support@7seapharmtech.com说明情况即可。
23. 流式抗体如何选择？
现在有各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测，选择时有以下几个原则：
(1) 流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接法，
即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往
会不同程度影响检测结果。
(2) 有一些抗体明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、Western
Blotting等，前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果
没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结
果不一定非常理想。
(3) 标记的荧光要根据实验方案确定，尽量使几个检测标记在不同的通路。
(4) 绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，它和FITC是一
个荧光通道，不能一起检测。可选用PE等其它荧光标记的抗体。
(5) 如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。一般倾向于选择多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。
(6) 单抗和多抗均可应用。