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逆转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase(RNase H-)
产品简介
莫洛尼氏鼠病毒逆转录酶（M-MLV RT）能以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。本逆转录酶是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNase H-的M-MLV反转录酶，RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。
来源
重组蛋白质（E.coli）；纯度>95%，没有检测到其他蛋白酶和核酸酶活力。
活力单位定义
以Poly (A)为模板，Oligo (dT)为引物，在37℃条件下，10分钟内催化掺入1 nmol dTTP所需酶量定义为1个活性单位(U)。
应用
用于 lst-Strand cDNA 的合成， RT-PCR 反应以及 Real Time RT-PCR 反应等。
储存条件
冰袋运输；长期保存-20℃或以下（12个月）； 避免反复冻融，建议分装保存5× M-MLV RT Buffer。
溶液成分
| M-MLV RT (RNase H-) 储存液 | 5X M-MLV RT Buffer |
|---|---|
| 20 mM Tris-HCl，pH 7.5 | 250 mM Tris-HCl，pH 8.3 |
| 100 mM NaCl | 250 mM KCl |
| 1 mM EDTA | 20 mM MgCl |
| 5 mM DTT | 50 mM DTT |
| 0.1%(v/v) TritonX-100 | |
| 50%（V / V）Glycerin |
使用示例
- 在微量离心管中，配制下列模板RNA/引物混合液：
Template RNA Total RNA 1ng-5μg poly(A) RNA 10pg-500ng Primer Oligo(dT)18 Primer 0.5μg(100pmol) Random Primers 0.2μg(100pmol) Specific Primer 10-20pmol DEPC-treated water Up to 12.5μl - 65℃保温5分钟后迅速在冰上冷却2分钟；
- 短暂离心后，加入以下组分：
5X M-MLV RT Buffer 4μl dNTP(10mM) 2μl M-MLV RT (RNase H-)(200U/μL) 1μl RNase Inhibitor 0.5μl Total volume 20μl - 42℃孵育1小时；
以Random Primers作为反转录引物时应先于25℃，反应10分钟，然后再于42℃条件孵育1小时。 - 70℃加热15分钟以终止反应。得到cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或PCR扩增。